Продукти
Набір Lifecosm для виявлення SARS-Cov-2 у режимі реального часу з використанням ПЛР для 2019-nCoV
Очікуване використання
Цей набір використовується для якісного виявлення нового коронавірусу (2019-nCoV) за допомогою мазків з горла, мазків з носоглотки, рідини бронхоальвеолярного лаважу, мокротиння. Результат виявлення цього продукту призначений лише для клінічного довідки та не повинен використовуватися як єдиний доказ для клінічної діагностики та лікування. Рекомендується комплексний аналіз стану в поєднанні з клінічними проявами пацієнта та іншими лабораторними тестами.
Принцип інспекції
Набір базується на технології одностадійної ПЛР у реальному часі. Фактично, гени ORF1ab та N нового коронавірусу 2019 року (2019-nCoV) були обрані як цільові області ампліфікації. Специфічні праймери та флуоресцентні зонди (зонди гена N мічені FAM, а зонди ORF1ab мічені HEX) призначені для виявлення РНК коронавірусу нового типу 2019 року у зразках. Набір також включає ендогенну систему виявлення внутрішнього контролю (зонд гена внутрішнього контролю, мічений CY5) для моніторингу процесу збору зразків, ампліфікації РНК та ПЛР, тим самим зменшуючи хибнонегативні результати.
Основні компоненти
| Компоненти | Обсяг(48T/Комплект） |
| Розчин для реакції RT-PCR | 96 мкл |
| Праймер nCOV Суміш зондів TaqMan（ORF1ab, ген N, ген RnaseP） | 864 мкл |
| Негативний контроль | 1500 мкл |
| Позитивний контроль nCOV (ген ORF1ab N) | 1500 мкл |
Власні реагенти: реагенти для екстракції або очищення РНК. Негативний/позитивний контроль: Позитивним контролем є РНК, що містить цільовий фрагмент, тоді як негативним контролем є вода, вільна від нуклеїнових кислот. Під час використання вони повинні брати участь в екстракції та вважатися інфекційними. З ними слід поводитися та утилізувати їх відповідно до чинних правил.
Внутрішнім референтним геном є ген RnaseP людини.
Умови зберігання та термін придатності
-20±5℃, уникати повторного заморожування та розморожування більше 5 разів, дійсний протягом 6 місяців.
Застосовуваний інструмент
З FAM / HEX / CY5 та іншими багатоканальними флуоресцентними ПЛР-приладами.
Вимоги до зразків
1. Застосовувані типи зразків: мазки з горла, мазки з носоглотки, рідина бронхоальвеолярного лаважу, мокротиння.
2. Збір зразків (асептична техніка)
Мазок з глотки: протріть мигдалики та задню стінку глотки двома тампонами одночасно, потім занурте головку тампона в пробірку, що містить розчин для взяття зразка.
Мокротиння: Після того, як пацієнт сильно кашляє, зібрати відкашляне мокротиння в пробірку з кришкою, що загвинчується, що містить розчин для взяття зразків; рідина бронхоальвеолярного лаважу: Забір зразків здійснюється медичними працівниками. 3. Зберігання та транспортування зразків
Зразки для виділення вірусу та тестування РНК слід протестувати якомога швидше. Зразки, які можна виявити протягом 24 годин, можна зберігати при температурі 4℃; ті, які неможливо виявити протягом 24 годин
години слід зберігати при температурі -70℃ або нижче (якщо умови зберігання не дорівнюють -70℃, їх слід
тимчасово зберігати в холодильнику при температурі -20℃). Зразки слід уникати повторного заморожування та розморожування під час транспортування. Зразки слід відправити до лабораторії якомога швидше після збору. Якщо зразки необхідно транспортувати на великі відстані, рекомендується зберігання в сухому льоду.
Методи випробувань
1 Обробка зразків та екстракція РНК (зона обробки зразків)
Рекомендується взяти 200 мкл рідкого зразка для екстракції РНК. Щодо відповідних етапів екстракції зверніться до інструкцій комерційних наборів для екстракції РНК. Як негативний, так і негативний
Контролі в цьому наборі були задіяні в екстракції.
2 Підготовка ПЛР-реагентів (зона підготовки реагентів)
2.1 Вийміть усі компоненти з набору, розморозьте їх та перемішайте за кімнатної температури. Центрифугуйте при 8000 об/хв протягом кількох секунд перед використанням; розрахуйте необхідну кількість реагентів, і реакційну систему готують, як показано в наступній таблиці:
| Компоненти | N порція (система 25 мкл) |
| Праймер nCOV Суміш зондів TaqMan | 18 мкл × N |
| Розчин для реакції RT-PCR | 2 мкл × N |
| *N = кількість протестованих зразків + 1 (негативний контроль) + 1 (nCOVпозитивний контроль) | |
2.2 Після ретельного перемішування компонентів, короткочасно центрифугуйте, щоб вся рідина на стінці пробірки осіла на дно пробірки, а потім аліквотуйте 20 мкл системи ампліфікації в пробірку для ПЛР.
3 Відбір проб (зона підготовки зразків)
Після екстракції додайте 5 мкл негативного та позитивного контролів. РНК зразка, що тестується, додайте до пробірки для ПЛР.
Щільно закрийте пробірку кришкою та центрифугуйте її при 8000 об/хв протягом кількох секунд, перш ніж перенести її в зону ампліфікаційного детектування.
4 ПЛР-ампліфікація (ампліфікована зона детекції)
4.1 Помістіть реакційну пробірку в комірку для зразка приладу та встановіть такі параметри:
| сцена | Цикл число | Температура(°C) | Час | колекціясайт |
| Зворотнийтранскрипція | 1 | 42 | 10 хв | - |
| Попередня денатураціяn | 1 | 95 | 1 хв | - |
| Цикл | 45 | 95 | 15 сек. | - |
| 60 | 30-ті роки | збір даних |
Вибір каналу детектування приладу: Виберіть канали FAM, HEX, CY5 для сигналу флуоресценції. Якщо вибрано NONE для еталонної флуоресценції, будь ласка, не вибирайте ROX.
5 Аналіз результатів (Будь ласка, зверніться до експериментальної інструкції кожного приладу для налаштування)
Після реакції збережіть результати. Після аналізу налаштуйте початкове значення, кінцеве значення та порогове значення базової лінії відповідно до зображення (користувач може налаштувати їх відповідно до фактичної ситуації, початкове значення можна встановити на 3~15, кінцеве значення можна встановити на 5~20) на логарифмічному графіку. На порозі вікна лінія порогу знаходиться в логарифмічній фазі, а крива ампліфікації негативного контролю є прямою лінією або нижче лінії порогу.
6 Якісний контроль (контроль процедури включено до тесту) Негативний контроль: немає чіткої кривої ампліфікації для каналів детекції FAM, HEX, CY5
Позитивний контроль COV: очевидна крива ампліфікації каналів детектування FAM та HEX, значення Ct ≤ 32, але крива ампліфікації каналу CY5 відсутня;
Вищезазначені вимоги повинні бути виконані одночасно в одному експерименті; інакше експеримент вважається недійсним і його потрібно повторити.
7 Визначення результатів.
7.1 Якщо в каналах FAM та HEX тестованого зразка немає кривої ампліфікації або значення Ct > 40, а в каналі CY5 є крива ампліфікації, можна вважати, що у зразку відсутня РНК нового коронавірусу 2019 року (2019-nCoV);
.2 Якщо тестований зразок має чіткі криві ампліфікації в каналах FAM та HEX, а значення Ct ≤40, можна вважати, що зразок є позитивним на новий коронавірус 2019 року (2019-nCoV).
7.3 Якщо тестований зразок має чітку криву ампліфікації лише в одному каналі FAM або HEX, а значення Ct ≤40, а в іншому каналі крива ампліфікації відсутня, результати необхідно повторно протестувати. Якщо результати повторного тестування узгоджуються, зразок можна вважати позитивним для нового
коронавірус 2019 (2019-nCoV). Якщо результат повторного тестування негативний, можна вважати, що зразок негативний на новий коронавірус 2019 (2019-nCoV).
Позитивна цінність судження
Метод ROC-кривої використовується для визначення референтного значення CT набору, а референтне значення внутрішнього контролю дорівнює 40.
Інтерпретація результатів тестування
1. Кожен експеримент слід перевіряти на наявність негативного та позитивного контролів. Результати тестування можна визначити лише тоді, коли контролі відповідають вимогам контролю якості.
2. Коли канали виявлення FAM та HEX позитивні, результат каналу CY5 (канал внутрішнього керування) може бути негативним через конкуренцію системи.
3. Якщо результат внутрішнього контролю негативний, а канали детектування FAM та HEX пробірки також негативні, це означає, що система вимкнена або її робота неправильна, а тест недійсний. Тому зразки необхідно протестувати повторно.
