Продукти
Набір Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR для виявлення 2019-nCoV
Очікуване використання
Цей набір використовується для якісного виявлення нового коронавірусу (2019-nCoV) за допомогою мазків із горла, носоглотки, рідини бронхоальвеолярного лаважу, мокротиння. Результат виявлення цього продукту призначений лише для клінічної довідки, і його не слід використовувати як єдиний показання для клінічної діагностики та лікування. Рекомендується комплексний аналіз стану в поєднанні з клінічними проявами пацієнта та іншими лабораторними дослідженнями.
Принцип перевірки
Набір заснований на одноетапній технології RT-PCR.Фактично, гени ORF1ab і N нового коронавірусу 2019 року (2019-nCoV) були обрані як цільові області ампліфікації.Спеціальні праймери та флуоресцентні зонди (зонди генів N помічені FAM, а зонди ORF1ab помічені HEX) призначені для виявлення РНК коронавірусу нового типу 2019 у зразках.Набір також включає ендогенну систему виявлення внутрішнього контролю (генний зонд внутрішнього контролю, позначений CY5) для моніторингу процесу збору зразків, ампліфікації РНК і ПЛР, тим самим зменшуючи помилково негативні результати.
Основні компоненти
| компоненти | Обсяг（48T/комплект） |
| Реакційний розчин ЗТ-ПЛР | 96 мкл |
| Праймер nCOV Суміш зондів TaqMan（ORF1ab, ген N, ген RnaseP） | 864 мкл |
| Негативний контроль | 1500 мкл |
| Позитивний контроль nCOV (ген ORF1ab N) | 1500 мкл |
Власні реактиви: реагенти для екстракції або очищення РНК.Негативний/позитивний контроль: позитивним контролем є РНК, що містить цільовий фрагмент, тоді як негативним контролем є вода без нуклеїнових кислот.Під час використання вони повинні брати участь в екстракції та вважатися інфекційними.З ними слід поводитися та утилізувати відповідно до відповідних норм.
Внутрішнім еталонним геном є ген RnaseP людини.
Умови зберігання та термін придатності
-20±5℃, уникайте повторного заморожування та розморожування більше 5 разів, дійсний протягом 6 місяців.
Застосовний інструмент
З FAM / HEX / CY5 та іншим багатоканальним флуоресцентним інструментом ПЛР.
Вимоги до зразка
1. Застосовні типи зразків: мазки з горла, мазки з носоглотки, рідина бронхоальвеолярного лаважу, мокротиння.
2. Збір зразків (асептична техніка)
Тампон із глотки: протріть мигдалики та задню стінку глотки двома тампонами одночасно, потім занурте головку тампона в пробірку з розчином для зразків.
Мокрота: після того, як у пацієнта з’явився глибокий кашель, зберіть відкашляне мокротиння в пробірку з гвинтовою кришкою, що містить розчин для зразків;рідина бронхоальвеолярного лаважу: відбір проб медичними працівниками.3. Зберігання та транспортування зразків
Зразки для виділення вірусу та тестування на РНК слід перевірити якнайшвидше.Зразки, які можна виявити протягом 24 годин, можна зберігати при 4 ℃;ті, які не можуть бути виявлені протягом 24
години повинні зберігатися при температурі -70 ℃ або нижче (якщо немає умов зберігання -70 ℃, вони повинні бути
тимчасово зберігається при -20 ℃ в холодильнику).Слід уникати повторного заморожування та відтавання зразків під час транспортування.Зразки слід відправити в лабораторію якомога швидше після збору.Якщо зразки необхідно транспортувати на великі відстані, рекомендується зберігати сухий лід.
Методи випробувань
1 Обробка зразка та екстракція РНК (зона обробки зразка)
Рекомендується брати 200 мкл рідкого зразка для виділення РНК.Відповідні етапи екстракції див. в інструкціях комерційних наборів для екстракції РНК.І негатив, і негатив
елементи керування в цьому наборі брали участь у вилученні.
2 Підготовка реагентів ПЛР (зона підготовки реагентів)
2.1 Вийміть усі компоненти з набору, розморозьте та перемішайте при кімнатній температурі.Перед використанням відцентрифугуйте при 8000 об/хв протягом кількох секунд;розраховують необхідну кількість реагентів і готують реакційну систему, як показано в наступній таблиці:
| компоненти | N порція (система 25 мкл) |
| Праймер nCOV Суміш зондів TaqMan | 18 мкл × N |
| Реакційний розчин ЗТ-ПЛР | 2 мкл × N |
| *N = кількість досліджених зразків + 1 (негативний контроль) + 1 (nCOVпозитивний контроль) | |
2.2 Після ретельного змішування компонентів відцентрифугуйте протягом короткого часу, щоб вся рідина зі стінок пробірки впала на дно пробірки, а потім аліквотуйте 20 мкл системи ампліфікації в пробірку для ПЛР.
3 Відбір проб (зона підготовки зразків)
Додайте 5 мкл негативного та позитивного контролів після екстракції.РНК досліджуваного зразка додають у пробірку для реакції ПЛР.
Щільно закрийте пробірку та центрифугуйте при 8000 об/хв протягом кількох секунд перед тим, як перенести її в зону виявлення ампліфікації.
4 ПЛР-ампліфікація (посилена область виявлення)
4.1 Помістіть реакційну пробірку в комірку приладу та встановіть наступні параметри:
| етап | Цикл номер | температура(°C) | час | колекціясайт |
| Зворотнийтранскрипція | 1 | 42 | 10 хв | - |
| Попередня денатураціяn | 1 | 95 | 1 хв | - |
| Цикл | 45 | 95 | 15с | - |
| 60 | 30-ті роки | збір даних |
Вибір каналу виявлення приладу: виберіть канал FAM、HEX、CY5 для сигналу флуоресценції.Для порівняння люмінесцентних ламп НЕМАЄ, будь ласка, не вибирайте ROX.
5 Аналіз результатів (будь ласка, зверніться до експериментальних інструкцій кожного приладу для налаштування)
Після реакції збережіть результати.Після аналізу налаштуйте початкове значення, кінцеве значення та порогове значення базової лінії відповідно до зображення (користувач може налаштувати відповідно до фактичної ситуації, початкове значення може бути встановлено на 3~15, кінцеве значення може бути встановлено на 5~20, коригування) на логарифмічному графіку На порозі вікна порогова лінія знаходиться в логарифмічній фазі, а крива ампліфікації негативного контролю є прямою лінією або нижче порогової лінії).
6 Контроль якості（Процедурний контроль включений у тест） Негативний контроль: немає очевидної кривої посилення для каналів виявлення FAM, HEX, CY5n
Позитивний контроль COV: очевидна крива ампліфікації каналів виявлення FAM і HEX, значення Ct≤32, але немає кривої ампліфікації каналу CY5;
Вищезазначені вимоги повинні бути виконані одночасно в одному експерименті;інакше експеримент недійсний і його потрібно повторити.
7 Визначення результатів.
7.1 Якщо немає кривої ампліфікації або значення Ct> 40 у каналах FAM і HEX досліджуваного зразка, і є крива ампліфікації в каналі CY5, можна судити про відсутність нового коронавірусу 2019 (2019-nCoV) РНК в зразку;
.2 Якщо тестовий зразок має чіткі криві ампліфікації в каналах FAM і HEX, а значення Ct становить ≤40, можна вважати, що зразок позитивний на новий коронавірус 2019 (2019-nCoV).
7.3 Якщо тестовий зразок має чітку криву ампліфікації лише в одному каналі FAM або HEX, а значення Ct становить ≤40, а в іншому каналі немає кривої ампліфікації, результати необхідно перевірити повторно.Якщо результати повторного тестування відповідають, зразок можна вважати позитивним для нового
коронавірус 2019 (2019-nCoV).Якщо результат повторного тесту негативний, можна вважати, що зразок негативний на новий коронавірус 2019 (2019-nCoV).
Позитивне судження
Метод кривої ROC використовується для визначення еталонного значення КТ набору, а контрольне значення внутрішнього контролю становить 40.
Інтерпретація результатів тесту
1. Кожен експеримент має бути протестований на негативний і позитивний контролі.Результати випробувань можна визначити лише тоді, коли контролі відповідають вимогам контролю якості
2. Якщо канали виявлення FAM і HEX позитивні, результат каналу CY5 (внутрішній канал керування) може бути негативним через конкуренцію систем.
3. Якщо результат внутрішнього контролю негативний, якщо канали виявлення FAM і HEX пробірки також негативні, це означає, що система вимкнена або операція неправильна, t тест недійсний.Тому зразки необхідно перевірити повторно.
